. 引言

沃特世XBridge BEH SEC 200Å和450Å 3.5 μm蛋白分析柱，設(shè)計(jì)用于補(bǔ)充現(xiàn)有基于UPLC的SEC應(yīng)用，配合傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)按SEC方法檢測(cè)肽或蛋白。這些新的HPLC型SEC填料，基于沃特世亞乙基橋雜化（BEH）顆粒技術(shù)及其表面覆蓋的二醇基鍵合相，與已經(jīng)得到成功運(yùn)用的UPLC SEC柱系列的色譜填料化學(xué)性質(zhì)*一致。這為了色譜技術(shù)人員提供了更多選擇，能夠基于實(shí)驗(yàn)室儀器平臺(tái)與樣品組分分離度情況或樣品分析通量需求輕松轉(zhuǎn)換。

所有基于BEH的SEC色譜柱，都是在通過(guò)cGMP（現(xiàn)行GMP）和ISO9001認(rèn)證的工廠里采用超純?cè)噭┥a(chǎn) 而得。生產(chǎn)出的每個(gè)批次填料，經(jīng)過(guò)一系列標(biāo)準(zhǔn)QC測(cè)試（例如，粒徑與孔徑分布），之后使用合適的肽和蛋白混標(biāo)進(jìn)行特定應(yīng)用測(cè)試。然后，對(duì)每一批獲得批準(zhǔn)放行的填料所裝填出的每一根SEC色譜柱，再進(jìn)行柱效測(cè)試。通過(guò)這樣的質(zhì)控過(guò)程，來(lái)確保在研發(fā)或?qū)Ω咭蟮尿?yàn)證方法提供批與批間、柱與柱間的重現(xiàn)性。

圖1. 在XBridge BEH SEC 200Å和450Å蛋白分析柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

II. 用于SEC蛋白質(zhì)分離的系統(tǒng)因素

a.啟動(dòng)

為了獲得沃特世 XBridge BEH SEC蛋白分析柱的*性能，正確配置您的LC系統(tǒng)很重要。我們建議只使用預(yù)切管路，且所有連接管的內(nèi)徑為0.005”或更小，以達(dá)到*色譜性能。

對(duì)于既有LC系統(tǒng)，要進(jìn)行SEC分析，可能需要進(jìn)行一些改造。請(qǐng)參考“使用ACQUITY UPLC系統(tǒng)進(jìn)行分子排阻色譜和離子交換色譜分析蛋白質(zhì)”

所采用的樣品環(huán)也可能影響您的分離性能。理想情況下，選擇應(yīng)用所需的zui低容量的樣品環(huán)。不建議使用大于20 μL的樣品環(huán)。

b.色譜柱的安裝

1. 將色譜柱接入系統(tǒng)之前，清除溶劑輸送系統(tǒng)中的任何有機(jī)溶劑或與水不互溶的流動(dòng)相。連接色譜柱時(shí)，按照色譜柱入口端側(cè)面上指示正確溶劑流向的箭頭方向，安裝色譜柱。

2. 用100%水相緩沖鹽，以0.2 mL/min的流速?zèng)_洗色譜柱。

3. 確保流動(dòng)相從色譜柱出口端順利流出。用內(nèi)徑為0.004” 的管路（部件號(hào)430001562），將色譜柱出口端連接至檢測(cè)器。監(jiān)視系統(tǒng)壓力，確保色譜柱處于其壓力限度以內(nèi)。

4. 逐漸提高流速，每次步進(jìn)不超過(guò)0.1mL/min，如第2步所述。

5. 一旦系統(tǒng)壓力穩(wěn)定了，確保無(wú)論是色譜柱進(jìn)口端還是出口端都沒(méi)有漏液。

c. 色譜柱的平衡

XBridge BEH SEC蛋白分析柱，保存在20%的甲醇水溶液中裝運(yùn)。在將其轉(zhuǎn)化到不同的流動(dòng)相體系之前，確保流動(dòng)相兼容性是至關(guān)重要的。zui少用10倍柱體積的緩沖液來(lái)平衡色譜柱（有關(guān)色譜柱體積，請(qǐng)參閱表1）。

表1.空色譜柱體積（單位：mL）（乘以10即為沖洗溶劑體積）。

d. 用于標(biāo)定LC系統(tǒng)和XBridge BEH SEC蛋白分析柱的功能測(cè)試

沃特世建議，您在收到色譜柱后以及在柱的整個(gè)使用壽命周期內(nèi)，都要進(jìn)行標(biāo)定測(cè)試。通過(guò)用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)常規(guī)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，您可以：

■收貨后就確定色譜柱的性能。

■監(jiān)測(cè)色譜柱狀態(tài)，以延長(zhǎng)使用期。

■對(duì)可能發(fā)生的分離問(wèn)題進(jìn)行故障排查。

沃特世BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）和BEH450 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006842）即專門為此目的所設(shè)計(jì)的產(chǎn)品，經(jīng)仔細(xì)選擇的蛋白質(zhì)和/或肽，可以很好地代表目標(biāo)應(yīng)用。

如下信息詳盡描述了如何配制和使用BEH SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)基準(zhǔn)化或故障排查。圖2和3提供了分離條件和預(yù)期您應(yīng)該獲得的結(jié)果。

流動(dòng)相配制

化學(xué)品：

■單水合磷酸二氫鈉

■無(wú)水磷酸氫二鈉

■HPLC級(jí)別水

配制100 mM磷酸鈉緩沖液（500mL）：

1. 量取500±0.02 g水至500 mL燒杯

2. 量取3.55±0.02 g磷酸氫二鈉，放入500 mL燒杯

3. 量取3.45±0.02 g磷酸二氫鈉，放入500 mL燒杯

4. 攪拌至少30分鐘，然后用0.2 µm膜過(guò)濾

5. 測(cè)量pH值并記錄以參考（pH值約為：6.8）

圖2.在XBridge BEH SEC 200, 3.5 μm, 7.8x150蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離。

表2. BEH200 SEC測(cè)試混標(biāo)。

條件：

儀器： ACQUITY UPLC系統(tǒng)，配TUV檢測(cè)器

色譜柱： ACQUITY UPLC BEH200 SEC, 200Å, 3.5μm,7.8 x 150mm

樣品： BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）

流動(dòng)相： 100 mM磷酸鈉，pH 6.8

弱針洗： 100%的Milli-Q 水

強(qiáng)針洗： 100%的Milli-Q 水

密封墊沖洗： 90/10水/甲醇

進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)

進(jìn)樣量： 2 μL

流速： 0.86 mL/min

柱溫： 室溫

檢測(cè)： UV@280 nm

圖3. 在XBridge BEH SEC 450, 3.5 μm, 7.8 x150 mm蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離

表3. BEH450 SEC測(cè)試混標(biāo)。

條件：

儀器： ACQUITY UPLC系統(tǒng)，配TUV檢測(cè)器

色譜柱： XBridge BEH SEC蛋白分析柱，450Å, 3.5 μm, 7.8 x 150 mm

樣品： BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）

流動(dòng)相： 100 mM磷酸鈉，pH 6.8

弱針： 100%的Milli-Q 水

強(qiáng)針洗： 100%的Milli-Q 水

密封墊沖洗： 90/10水/甲醇

進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)

進(jìn)樣量： 2 μL

流速： 0.86 mL/min

柱溫： 室溫

檢測(cè)： UV@280 nm

III. 色譜柱指標(biāo)與使用

為確保XBridge BEH SEC 3.5 μm蛋白分析柱持久的高性能，請(qǐng)遵守以下操作規(guī)范：

a. SEC洗脫液與針洗液的制備

■如果可能，請(qǐng)使用HPLC級(jí)的緩沖液、水和有機(jī)溶劑。

■使用0.2 μm或更小孔徑的濾膜過(guò)濾溶液。對(duì)于可以滋生微生物的緩沖液，推薦使用無(wú)菌過(guò)濾裝置。

■容易滋生微生物的溶液應(yīng)定期更換，以避免色譜柱污染。不要把新配制流動(dòng)相又倒入舊的SEC流動(dòng)相樣品瓶中。新鮮配制的SEC流動(dòng)相，應(yīng)該使用新的溶劑瓶。

■選擇與所用溶液兼容的溶劑進(jìn)樣口過(guò)濾器。當(dāng)使用容易滋生微生物的溶液時(shí)，要定期清洗或更換過(guò)濾器。

b. 樣品制備

■在進(jìn)樣到SEC色譜柱上之前，確保樣品中沒(méi)有微粒。如果樣品出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致柱壓 升高?？梢缘脑挘褂眠^(guò)濾或離心方式制備樣品。

■如果樣品不能溶解于流動(dòng)相，請(qǐng)確保樣品、樣品溶劑和 流動(dòng)相可以互溶，以避免樣品和/或緩沖鹽沉淀。

c. 色譜柱指標(biāo)

■柱裝運(yùn)溶劑： 20%的甲醇水溶液

■推薦zui大流速和背壓：

■ XBridge BEH SEC 200蛋白分析柱，7.8 x 150 mm:4 mL/min/2,600 psi

■ XBridge BEH SEC 200蛋白分析柱，7.8 x 300 mm:2.7 mL/min/3,200 psi

■ XBridge BEH SEC 450蛋白分析柱，7.8 x 150mm:4 mL/min/2600psi

■ XBridge BEH SEC 450蛋白分析柱，7.8 x 300mm:2.7 mL/min/3200psi

■ 樣品質(zhì)量載量：< 300 μg（對(duì)于7.8x150mm）

■ 樣品體積載量：< 60 μL（對(duì)于7.8x 150 mm）

■ 推薦的pH值范圍：2～8。色譜柱使用壽命會(huì)隨操作溫度以及所用緩沖液的類型和濃度的不同而有所不同。

■ 推薦的鹽濃度：小于或等于0.5 M

■ 推薦的有機(jī)相濃度：< 20% 乙腈（警告：許多蛋白質(zhì)在高比例有機(jī)相中不可溶。）進(jìn)行色譜分析前，進(jìn)行測(cè)試以確保樣品在擬用于色譜分析的有機(jī)相濃度下不會(huì)發(fā)生沉淀。此外，如果色譜柱在蛋白變性條件（大于10%的有機(jī)相）下運(yùn)行，之后在100%水相條件下使用時(shí)色譜柱性能可能會(huì)受到影響。

■ 推薦溫度：4 – 60°C。低溫（例如10°C）下操作時(shí)要降低流速，以免柱壓過(guò)大。

■ 推薦儲(chǔ)存：若要隔夜儲(chǔ)存，用流動(dòng)相以10-20%的zui大推薦流速持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時(shí)內(nèi)使用，可將柱保存于HPLC級(jí)純水中；或放在10-20%的甲醇中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

注：在壓力、pH值和/或溫度下操作時(shí)，會(huì)致使色譜柱使用壽命變短。

IV. 故障排查

系統(tǒng)性故障排查的*步，是將色譜柱當(dāng)前狀態(tài)下的性能與正常工作時(shí)的性能進(jìn)行比較。用蛋白質(zhì)混標(biāo)進(jìn)行功能測(cè)試，可揭示柱填料表面化學(xué)的微妙變化對(duì)應(yīng)用的影響。

有幾種常見(jiàn)的色譜柱變化癥狀：

1. 壓力升高通常與應(yīng)用中的性能下降在一起。診斷的*步是確保壓力升高發(fā)生在色譜柱中，而不是在系統(tǒng)中的其他地方。這可通過(guò)從出口端到進(jìn)口端逐一斷開(kāi)連接并同時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)壓力情況來(lái)確定。如果系統(tǒng)被堵塞，則應(yīng)查明堵塞處并排除堵塞。如果增高壓力發(fā)生在色譜柱中，了解問(wèn)題是與單次進(jìn)樣有關(guān)還是發(fā)生在一系列進(jìn)樣后會(huì)很有幫助。如果壓力是逐漸形成的，則很可能需要按第五節(jié)所述對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗。如果是一個(gè)樣品造成的壓力上升，則很可能表示有顆?；虿豢扇艿某煞?，如脂類或較高階聚合物。清洗仍然是一種選擇，但要采用更激烈的方式。如果樣品溶液出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致壓力升高。可以進(jìn)行樣品制備例如過(guò)濾或離心，但首先應(yīng)檢查是否會(huì)影響結(jié)果。

2. 微生物污染會(huì)造成分離度損失和峰拖尾增加。重要的是，遵循良好的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范以預(yù)防微生物污染，包括經(jīng)常更換緩沖液溶劑瓶、使用高純度水、使用無(wú)菌過(guò)濾裝置、以及在建議的條件下保存系統(tǒng)和色譜柱。如果已經(jīng)發(fā)生微生物污染，清洗色譜柱不會(huì)影響性能。改變流速時(shí)，請(qǐng)按0.1 mL/min的步進(jìn)速度緩慢增加，避免流速增加時(shí)大于0.1 mL/min步進(jìn)。

3. 峰拖尾增加，可能是由于管路連接不當(dāng)，或是由于色譜柱進(jìn)樣端篩板上的物質(zhì)積聚。在繼續(xù)進(jìn)行診斷或采取糾正措施前，請(qǐng)檢查所有的管路連接、流動(dòng)相是否制備得當(dāng)、并選擇了正確的方法。然后重復(fù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。 如果蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品都呈現(xiàn)峰拖尾增加，則很可能在色譜柱入口端有顯著的物質(zhì)累積問(wèn)題，需要更換色譜柱。

4. 殘留是指一次進(jìn)樣的樣品組分出現(xiàn)在下一次分析譜圖中。在SEC中，殘留一般是由系統(tǒng)部件或不正確的清洗溶劑造成的。進(jìn)行一次空白進(jìn)樣。如果蛋白質(zhì)峰值僅出現(xiàn)在進(jìn)樣時(shí)，則它們很可能源于系統(tǒng)部件或清洗溶劑不足。系統(tǒng)部件中的吸附zui可能發(fā)生在進(jìn)樣環(huán)或 針中。在這些情況下，可能需要更換部件。

V. 色譜柱清洗、再生與儲(chǔ)存

a. 清洗與再生

峰形的變化，如增加拖尾、肩峰、保留時(shí)間改變、分離度變化、鬼峰或柱背壓升高，都可能表示色譜柱被污染了。選擇一種有望解決疑似污染的清洗方法。

按該色譜柱所采用的典型流速的一半來(lái)執(zhí)行清洗程序可能有用。用這種方式，降低了高背壓事件的發(fā)生概率。

推薦的清洗溶劑：

a. 低pH值的高濃度鹽溶液（如：0.5 M Na2SO4, pH 2.7）

b. 低濃度甲醇（如：20%）溶于HPLC級(jí)的水中。

c. 如果色譜柱隨后要用于分析天然形態(tài)的蛋白質(zhì)，應(yīng)避免使用離子型洗滌劑和其他表面活性劑。

注：根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇清洗溶劑，如：用(a)去除堿性蛋白， 用(b)去除疏水性蛋白。消泡劑（Chaotropic agents）通過(guò)干擾氫鍵作用使強(qiáng)烈吸附的蛋白質(zhì)溶劑化。

作為后的手段，可以嘗試在低流速（如0.1 mL/min）下進(jìn)行倒 流或反沖洗。然而，這種方法可能會(huì)進(jìn)一步損害色譜柱，或者只能提供短暫的性能改進(jìn)。

b. 儲(chǔ)存

若要隔夜儲(chǔ)存，用流動(dòng)相以10～20%的zui大推薦速度持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時(shí)內(nèi)使用，將色譜柱儲(chǔ)存在HPLC級(jí)的純水中；或放在20%的甲醇中作為長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

注：在壓力、pH和/或溫度條件下操作，會(huì)縮短色譜柱使用壽命。